Genotoxicity and exposure to chemicals. Health risk.
Aiassa, Delia Elba[1]
RESUMEN: Desde 2006, en el Departamento de Ciencias Naturales de la Facultad Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Río Cuarto (Río Cuarto, Córdoba, Argentina), se llevan a cabo estudios in vitro en sangre periférica humana y de otros vertebrados, así como otros in vivo en modelos experimentales (animales y vegetales) y estudios en poblaciones humanas, destinados a analizar la genotoxicidad de sustancias químicas. En este marco, las investigaciones han estado centradas principalmente en la evaluación de los efectos genotóxicos de los plaguicidas más utilizados en la provincia de Córdoba. Los análisis de genotoxicidad se complementan con estudios de Legislación, Investigación Educativa y Divulgación Científica. En el presente artículo se resumen los principales resultados obtenidos en estos 15 años de trabajo. La aplicación de ensayos de genotoxicidad en sus diferentes niveles de complejidad es útil para detectar posibles efectos a largo plazo de sustancias que se introducen al mercado, cuando no se conoce con exactitud su capacidad de afectar la salud humana y ambiental.
PALABRAS CLAVE: Genotoxicidad. Salud. Ambiente. Plaguicidas. Legislación ambiental.
ABSTRACT: Since 2006, in the Department of Natural Sciences of the Faculty of Exact, Physical-Chemical and Natural Sciences of the National University of Río Cuarto (Río Cuarto, Córdoba, Argentina), in vitro studies in human peripheral blood and other vertebrates, as well as in vivo studies in experimental models (animals and plants) and studies in human populations, have been carried out to analyze the genotoxicity of chemical substances. In this framework, research has been mainly focused on the study of the genotoxic effects of the most widely used pesticides in the province of Córdoba. Genotoxicity analyses are complemented with Legislation, Educational Research and Scientific Dissemination studies. This article summarizes the main results obtained in theses 15 years of work. The application of genotoxicity tests at different levels of complexity is useful to detect possible long-term effects of substances that are introduced to the market, when their ability to affect human and environmental health is not exactly known.
KEY WORDS: Genotoxicity. Health. Environment. Pesticides. Environmental legislation.
Introducción
La evaluación del riesgo de sufrir deterioro en la salud, expresada como la probabilidad de que un efecto no deseado ocurra como resultado de una exposición a agentes tóxicos, puede realizarse a través de biomarcadores (i. e. alteraciones bioquímicas y/o celulares) y a distintos niveles de complejidad: estudios in vitro (en líneas celulares o células), estudios in vivo (en modelos animales y vegetales) y estudios epidemiológicos (en poblaciones).
Los biomarcadores se pueden clasificar en: (a) biomarcadores de exposición: evalúan en un organismo la presencia de un agente del ambiente externo, un metabolito o el producto de la interacción entre el agente (compuestos naturales o sintéticos del ambiente que el organismo metaboliza y acumula) y una molécula o célula diana (célula que reacciona con el agente); (b) biomarcadores de susceptibilidad: indican la capacidad heredada o adquirida de un organismo para responder a la exposición a un agente externo; y (c) biomarcadores de efecto: evalúan la alteración bioquímica, fisiológica o de comportamiento producida en el organismo que puede ser asociada con una enfermedad (Arango, 2011).
Los biomarcadores de daño en el material genético -biomarcadores de genotoxicidad-aberraciones cromosómicas (AC), micronúcleos (MN), intercambio de cromátidas hermanas (ICH) y fragmentación del ADN (ensayo cometa), son biomarcadores de efecto que representan la afectación del material genético por el agente físico, químico o biológico, ya absorbido en el organismo. Son una señal de alerta temprana que indica que agentes externos/ medioambientales, hábitos de vida o la interacción de ambos, alteran el material genético, incidiendo sobre la integridad del mismo. AC y MN son biomarcadores citogenéticos validados internacionalmente como ensayos indicadores de genotoxicidad. Organismos como la OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) y la EPA (Environmental Protection Agency) publica los protocolos para la realización de tales ensayos, y son los ejes referenciales en todo el mundo para la comparación de datos provenientes de distintas fuentes, y el establecimiento de las características nocivas potenciales de una sustancia. Las AC son cambios en la estructura y/o el número que pueden sufrir los cromosomas y que reflejan una enorme plasticidad del material genético (Natarajan y Obe, 1980; Caporale, 1999). Son roturas, visibles microscópicamente en los cromosomas, inducidas por agentes que dañan las moléculas de ADN de los mismos y sus cromátidas, que son partes componentes de los cromosomas (Natarajan, 1976; Roberts, 1978; Singer y Grunberger, 1983). Los MN se forman a partir de fragmentos cromosómicos o cromosomas completos que no quedan incluidos en los núcleos de las células “hijas” durante la división celular, y se pueden visualizar través del microscopio óptico en diferentes tejidos como la sangre y el tejido epitelial. En particular, las células epiteliales exfoliadas de la boca y de la nariz se han utilizado en el control biológico de personas expuestas a contaminantes transportados por el aire, ya que son representativas de las células del tracto respiratorio epitelial y son más fáciles de recolectar que las de otros órganos respiratorios (Holland et al., 2008; Coronas et al., 2009; Ceppi et al., 2010; Bonassi, Coskun et al., 2011; Kashyap y Reddy, 2012; Samanta y Dey, 2012).
En cuanto a los niveles de complejidad, los estudios de genotoxicidad in vitro, si bien no tienen en cuenta la absorción, distribución, metabolización y excreción del agente a estudiar, permiten evaluar el potencial efecto de los contaminantes. Los estudios in vivo aportan un marco fisiológico a la acción de distintos agentes con potencial genotóxico, habilitan a una evaluación controlada de la respuesta integral del agente en cuestión y permiten también discernir los efectos provocados según la vía de ingreso del agente al organismo. Así, estos estudios aportan resultados que están un paso más cerca de las exposiciones humanas reales.
Con respecto a los estudios epidemiológicos que utilizan biomarcadores de genotoxicidad cobran mayor relevancia si la caracterización ambiental es dificultosa y/o si el sitio a estudiar presenta agentes químicos de procedencia y contenido variables. Es por lo señalado que estos estudios adquieren importancia en la investigación en salud pública, en especial en aquellos países donde los problemas ambientales no son de alta prioridad (Ilizaliturri Hernández et al. 2009).
Es de destacar que el daño evidenciado por los biomarcadores genotóxicos puede revertirse si se elimina o disminuye el agente que lo causa. Si el organismo no logra reparar el daño genotóxico en las células somáticas y se hace permanente, los efectos son asociados con el desarrollo de enfermedades crónico-degenerativas como el alzhéimer, el mal de Parkinson, cardiopatías, diabetes mellitus y cáncer (Andreassi et al., 2011). Cuando el daño ocurre en células germinales (óvulos o espermatozoides) se vincula con problemas reproductivos y trastornos del desarrollo en la descendencia, los cuales derivan, por ejemplo, en defectos observables en el nacimiento (Scambler, 1993). De manera similar, en cuanto a grupos etarios de poblaciones humanas, es de enfatizar que los niños pueden presentar una mayor sensibilidad a los agentes tóxicos en comparación con los adultos y que el daño en el material genético ocurrido a edades tempranas puede representar efectos adversos para la salud del adolescente o adulto (Landrigan et al., 2004; Roberts y Karr, 2012). Sin embargo, la información disponible sobre los efectos genotóxicos en los niños es escasa en nuestro país.
Sobre esta base, se resumen en este artículo los principales resultados obtenidos en los últimos 15 años en el Laboratorio de Genética y Mutagénesis Ambiental del Departamento de Ciencias Naturales de la Facultad Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Río Cuarto (Río Cuarto, Córdoba, Argentina) a partir de la utilización de biomarcadores de genotoxicidad en (a) estudios in vitro en células humanas, (b) estudios in vivo en modelo animal y vegetal, y (c) biomonitoreo de población humana, complementados con (d) estudios de legislación ambiental, (e) investigación educativa y (f) divulgación científica.
Contribución al conocimiento de la genotoxicidad de contaminantes químicos ambientales
- Estudios in vitro
En el trabajo de Barbosa et al. (2017) se evaluó el potencial genotóxico de una formulación comercial de glifosato (glifosato II-Atanor®, glifosato 43.8 %) en sangre periférica humana por medio del ensayo cometa (fragmentación del ADN). Conjuntamente se determinó la concentración de especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) para cuantificar la peroxidación lipídica, proceso que ocurre bajo condiciones de estrés oxidante. Todas las concentraciones de glifosato en formulación comercial probadas produjeron un aumento estadísticamente significativo de daño genotóxico respecto al testigo negativo. Se halló una correlación entre el aumento de la lipoperoxidación y la fragmentación de ADN, por lo que se estima que el estrés oxidante podría ser uno de los principales factores que estarían alterando el funcionamiento normal de las células, entendiéndose a este proceso como la principal consecuencia de una exposición a glifosato.
En otro reporte (Vilchez et al., 2017) se analizó el potencial genotóxico de glifosato, cipermetrina y clorpirifos utilizando células humanas (linfocitos) también a través del ensayo cometa (fragmentación del ADN). Los resultados obtenidos indicaron que los tres plaguicidas más utilizados en la actividad agropecuaria de la provincia de Córdoba son riesgosos para el medio ambiente o la salud humana, lo que quedó demostrado a través de su actividad genotóxica.
Por otro lado, el ensayo cometa fue utilizado con el objetivo de evaluar in vitro algunos potenciales efectos terapéuticos del extracto etanólico de romero (Rosmarinus officinalis L.) en células sanguíneas de cabras. Cecchini, Roma, Pussetto et al. (2018) informaron que el extracto de romero presenta actividad protectora del ADN. Los resultados obtenidos podrían asociarse con un efecto antioxidante del extracto.
- Estudios in vivo en modelos experimentales
En modelos animales se trabajó con anfibios, aves y cabras. En el primer caso, Odontophrynus cordobae y Rhinella arenarum (Amphibia: Anura) fueron expuestos a diferentes concentraciones de un plaguicida con glifosato al 48% (Roundup®) y a ciclofosfamida como control positivo. La frecuencia de eritrocitos con micronúcleos (MNE) en O. cordobae aumentó después de la exposición a glifosato. La frecuencia de MNE en R. arenarum fue superior a la frecuencia basal o espontánea, como ocurrió en el grupo expuesto a ciclofosfamida. En cuanto a la toxicidad aguda y la genotoxicidad, los resultados mostraron que O. cordobae es más sensible a la exposición a glifosato que R. arenarum. Se detectó una correlación entre la concentración de exposición y la frecuencia de MNE en R. arenarum (Bosch et al., 2011). Además del daño en el material genético por exposición a glifosato que se evidenció en este trabajo, la validación de sistemas in vivo, como la prueba de micronúcleos en sangre periférica de O. cordobae, aporta un sustento científico a los estudios in situ sobre los riesgos potenciales que produce la exposición ambiental a agentes genotóxicos. El aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de MNE en O. cordobae y R. arenarum expuestos a ciclofosfamida valida el uso de muestras de animales postmetamórficos en el ensayo de micronúcleos. También, la observación de las frecuencias basales de MNE en O. cordobae permitirá la implementación de este biomarcador para el diagnóstico y seguimiento de la calidad ambiental (Mañas et al., 2017).
En relación con aves, Origlia (2019) observó que Milvago chimango y Falcus sparvelius presentaron un escaso número de MN espontáneos (valores basales de MN) en muestras analizadas provenientes de la provincia argentina de La Pampa). Esta característica las clasificaría como especies que no podrían ser usadas como bioindicadoras de contaminación ambiental. El estudio se consideró no concluyente porque faltaría realizar el análisis en épocas de exposición alta a genotóxicos conocidos y/o estudios in vitro, para poder examinar el comportamiento de los MN frente a diferentes situaciones de exposición.
En otro vertebrado, Cecchini, Roma, Magnago et al. (2018) analizaron el daño genotóxico en sangre de cabras alimentadas con una dieta suplementada con linaza, en un período de tres meses. El trabajo explicó el efecto antigenotóxico de la mencionada dieta mediante los ensayos de micronúcleos y cometa, entre otros parámetros estudiados.
En un modelo vegetal (células meristemáticas de bulbos de cebolla, Allium cepa), se evaluaron diferentes concentraciones de glifosato (principio activo) y su formulado Atanor II. Ambos compuestos químicos produjeron un aumento de aberraciones cromosómicas a partir de la concentración de 1440 µg/l, demostrando la genotoxicidad de los mismos. Los resultados indicaron que este herbicida causa daño en el material genético, como así también alteraciones en el funcionamiento del ciclo celular, en concentraciones 1000 veces más bajas que las utilizadas en el campo (Roma, 2016).
- Genotoxicidad en poblaciones humanas
Para evaluar genotoxicidad en poblaciones humanas, es útil dividirlas en función de si son personas laboralmente expuestas (aplicadores) o ambientalmente expuestas, distinguiendo en este último caso entre niños y adultos. Con relación a personas laboralmente expuestas se trabajó con aplicadores de plaguicidas de la zona rural de la provincia de Córdoba (Mañas et al., 2009; Aiassa et al., 2010; Gentile et al., 2012; Aiassa et al., 2019). En todos los trabajos realizados se encontró mayor frecuencia de daño genotóxico en los trabajadores rurales en comparación con el grupo de referencia (sin actividad rural). Los resultados ponen de manifiesto el riesgo que representa la exposición a plaguicidas para la salud de esta población. Cabe destacar que un aumento de daño en el material genético indica riesgo aumentado de padecer cáncer. Además de tener como objetivo identificar de manera precoz los potenciales daños a la salud en individuos expuestos por razones laborales a plaguicidas, se estudió a las personas con las que conviven, empleándose como biomarcadores citogenéticos la frecuencia de aberraciones cromosómicas y micronúcleos en linfocitos de sangre periférica y en células de la mucosa bucal. Los resultados mostraron un aumento en el daño en el material genético de los convivientes, por lo que son indicativos de la necesidad de realizar un biomonitoreo genotóxico con frecuencia periódica de los trabajadores rurales expuestos a varias mezclas de plaguicidas, como así también a los individuos que conviven con éstos. Asimismo, ilustran la necesidad de promover pautas generales para minimizar o prevenir la exposición (Gentile et al., 2016).
En cuanto a poblaciones ambientalmente expuestas, la situación de algunas localidades estudiadas en la provincia de Córdoba (p. ej. Las Vertientes, Marcos Juárez, Oncativo) es compleja. En éstas existe una alta frecuencia de aplicación de plaguicidas, los pobladores viven a corta distancia de los cultivos; además, la variedad de plaguicidas utilizados y el uso inapropiado del suelo por aplicación intensiva de estas sustancias alteran las condiciones agroecológicas, y todo lo anterior es posible que potencie las condiciones adversas para la salud de la población (Gentile et al., 2015). En este contexto, dos trabajos reportaron que el daño genotóxico en niños aumenta significativamente en relación con la cercanía de sus residencias a las tierras de cultivo tratadas con plaguicidas (Aiassa et al., 2014; Bernardi et al., 2015). Otro trabajo informó que personas adultas ambientalmente expuestas de una zona agrícola también presentan daño genotóxico aumentado (Peralta et al., 2011).
El aumento de daño genotóxico también fue detectado en residentes de las localidades cordobesas Río Cuarto, Sampacho, Las Vertientes y Las Higueras, que están ambientalmente expuestas a otros contaminantes ambientales. La exposición a concentraciones de arsénico en agua dentro de los límites permitidos por la legislación vigente para la provincia de Córdoba, pero mayores que lo sugerido por la Organización Mundial para la Salud (Varea, 2016), y a concentraciones altas de partículas de polvo suspendidas en el aire (Milanesio, 2017) mostraron aumento de micronúcleos en la mucosa bucal de los participantes de los estudios.
Frente a los resultados obtenidos y los que informa la bibliografía internacional, los ensayos de genotoxicidad deberían ser considerados como herramientas indispensables en la implementación de la vigilancia médica completa en personas potencialmente expuestas a diversos contaminantes ambientales (Aiassa, Mañas et al., 2012; Varea et al., 2016).
- Legislación
En materia de Legislación Ambiental, se realizó el análisis comparado de la normativa vigente en Río Cuarto teniendo en cuenta el grado real de eficacia y eficiencia, así como las dificultades conceptuales y operativas que surgen de la misma. Las actividades mencionadas fueron la base para la confección de un documento que reúne, clasifica, ordena y propone la armonización de las normas correspondientes a la Legislación Ambiental de Río Cuarto (Aiassa et al., 2008).
La normativa sobre agroquímicos en la República Argentina fue revisada y analizada por Gómez Miralles, Bevilacqua y Bevilacqua (2012), con la finalidad de describir el conjunto de las normas jurídicas vigentes en el país, relacionadas con el uso de los plaguicidas utilizados en las prácticas rurales, que prescriben las conductas que el derecho permite o prohíbe.
En otro análisis (Gómez Miralles, Bevilacqua, Mañas et al., 2012) se informó que la Ley 24 051, de residuos peligrosos, a través de las infracciones penales previstas en sus artículos 55 a 58, ejerce la prevención general negativa, con el objeto de lograr un efecto disuasivo en las conductas de los aplicadores agropecuarios. Sin perjuicio de ello, se considera que la aplicación de esta ley no es suficiente, y se debería instituir una regulación ambiental específica que prevea figuras penales vinculadas con la utilización de plaguicidas, a fin de controlar el uso de los mismos y lograr una mejor protección de la salud y del ambiente en general.
Los efectos potencialmente dañinos de los plaguicidas sobre la salud humana a largo plazo no son solo una preocupación de la comunidad científica, sino también de los pobladores de localidades rodeadas de cultivos. La misma ha sido manifestada en numerosas causas judiciales promovidas con fines de resguardar la salud humana y ambiental. En estas últimas, se han dictado fallos judiciales para regular las aplicaciones en situaciones particulares, en los que se les atribuye a los plaguicidas efectos sobre la salud. El nuevo Código Civil y Comercial de la Nación (Argentina), que entró en vigencia en 2015, promueve la efectiva realización de los principios básicos de política ambiental, ampliando las facultades de los magistrados para su efectiva aplicación (Bevilacqua y Abasolo, 2018). De esta forma, el análisis de los fallos judiciales en materia de plaguicidas es una estrategia importante para comprender cuán vulnerables son esas poblaciones humanas y las bases en materia de evaluación de riesgo para la salud y el ambiente, sobre las que se asientan esas decisiones.
- Investigación educativa
La evidencia de riesgo en la salud como resultado de la exposición por el uso intensivo de plaguicidas indicó la necesidad de trabajar con las poblaciones más vulnerables desde el área de la educación. Desde este aspecto, se articularon actividades educativas en hogares de trabajadores rurales y representantes del ámbito docente del suroeste de la provincia de Córdoba (Gentile et al., 2010). También se realizaron encuestas a estudiantes de dos organizaciones educativas de enseñanza secundaria (rural y urbana) de la provincia, con la finalidad de presentar un diagnóstico de la situación en materia del uso doméstico de plaguicidas, así como las estrategias educativas realizadas concordantes con los resultados obtenidos (Bosch et al., 2013).
- Divulgación científica
La divulgación científica se realizó en el marco de las convocatorias destinadas a la transferencia de resultados de investigación que tienden a incrementar la cultura científica del público y de los distintos estamentos sociales. En este marco, se consideró que la pasión por la ciencia y la investigación genera indefectiblemente la necesidad de comunicarla, no solo en el ámbito científico sino a la comunidad. Con las obras publicadas (Aiassa, Bosch y Mañas, 2012; Aiassa y Bosch, 2015, 2018; Steinmann et al., 2019) se aportaron los resultados obtenidos sobre los efectos de los plaguicidas en los organismos y el ambiente, junto a los resultados de otros autores, mediante un lenguaje sencillo y comprensible para la generalidad de los ciudadanos. La finalidad planteada fue que lector no especializado con la lectura pueda formar una opinión sobre los efectos de los plaguicidas en la salud humana y ambiental.
Consideraciones finales
Desde hace tiempo se conoce que existe una estrecha relación entre las alteraciones en el ADN de las células y el cáncer y las enfermedades degenerativas crónicas. El proceso cancerígeno se inicia y se favorece por la presencia de alteraciones/mutaciones en zonas donde se encuentran oncogenes y genes supresores de tumores, y en las que codifican para los sistemas de reparación del ADN (Au et al., 2001; Bonassi y Au, 2002). La presencia de un alto nivel de aberraciones cromosómicas y/o micronúcleos fue asociada al aumento en el riesgo de presentar procesos cancerígenos (Bonassi et al., 2007; Bonassi, El Zein et al., 2011).
En 2007, Bonassi et al. informaron, después de 25 años de investigaciones, que la frecuencia de AC se puede usar para predecir el cáncer. Todos los estudios que midieron la relación entre la frecuencia de aberraciones cromosómicas y el riesgo de cáncer reportaron resultados positivos. Estos hallazgos, respaldados por los sólidos antecedentes teóricos que vincularon los reordenamientos cromosómicos con las etapas tempranas del origen del cáncer, contribuyeron significativamente a la comprensión del proceso cancerígeno. Fundamento de esto fue el alto número de citas (alrededor de 500 en general) de los estudios sobre el tema, y las tendencias cada vez mayores de las publicaciones sobre el daño cromosómico como un buen biomarcador para el cáncer.
En el mismo sentido para los micronúcleos, los resultados de un análisis prospectivo de una base de datos de 6700 sujetos de 20 laboratorios representando a diez países diferentes confirmaron que una frecuencia elevada de micronúcleos es predictiva de un riesgo aumentado de padecer cáncer (Bonassi et al., 2007). Así también, un estudio reciente realizado en Argelia (Laanani et al., 2018) mostró que las parejas con infertilidad idiopática (de causa desconocida), en comparación con los controles, tenían una frecuencia significativamente mayor de biomarcadores de daño genotóxico (MN).
Finalmente, en cuanto a actividades que presentan mayor exposición a agentes genotóxicos en nuestro país, podrían señalarse las que se realizan en la industria y la agricultura. Desde los años 90 se reporta que los plaguicidas son compuestos que pueden reaccionar con las moléculas celulares, incluyendo el ADN, es decir, son sustancias químicas genotóxicas. Idealmente los plaguicidas deberían afectar sólo al organismo blanco; sin embargo, este deseo es raramente alcanzado debido a las similitudes en los procesos básicos de la vida del organismo blanco y de los organismos no-blanco (Veleminsky y Gichner, 1992).
En este contexto, la evidencia científica respecto a la genotoxicidad de las sustancias químicas aplicadas en la Argentina debería ser tomada como una herramienta de advertencia temprana, eficaz para la protección de la salud. Esta información tendría que ser utilizada en la toma de decisiones referidas a la salud pública y/o al ámbito judicial. Además, brinda bases sólidas para el diseño de proyectos específicos y de seguimiento enmarcados en propuestas de políticas públicas y sociales para acciones en salud humana y ambiental.
Con toda la evidencia epidemiológica y experimental con la que se cuenta, se puede afirmar que es factible prevenir situaciones adversas para la salud (p. ej. cáncer) por exposición ocupacional o ambiental a sustancias genotóxicas, y que los obstáculos que se presentan para prevenirlas no son de naturaleza técnica, científica o médica, sino política y/o económica (Aiassa, 2018a, 2018b).
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- GeMA – Genética y Mutagénesis Ambiental. Departamento de Ciencias Naturales. Facultad Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina. delia.aiassa@gmail.com ↑